Obniżona aktywność urokinaza oskrzelowo-pęcherzykowego u pacjentów z zespołem zaburzeń oddechowych dorosłych cd

Próbki po płukaniu od pacjentów z ARDS badano empirycznie w zakresie rozcieńczeń, aż hamowanie aktywności plazmin było proporcjonalne do objętości dodanego płynu płuczącego. Całkowite stężenia białka w płynie do płukania oznaczono metodą Lowry i in. z użyciem albuminy surowicy bydlęcej w standardzie.11 Wyniki wyrażono jako mikrogramy plazminy hamowanej na mikrogram białka całkowitego w płynie do płukania. [125I] Test konwersji plazminogenu
[125I] Test konwersji plazminogenu z Loskutoff i Edgington został użyty do bezpośredniej oceny działania urokinazy w płynie do płukania.12 W tym teście, cięcie plazminogenu przez urokinazy lub tkankowego aktywatora plazminogenu w celu utworzenia plazmin można ocenić niezależnie od antypassminów, które może być obecny. W skrócie, probówki wirówkowe zawierające 2 do 5 ul [125I] plazminogenu i 25 do 50 ul płynu do płukania (lub buforu zawierającego znaną ilość urokinazy) inkubowano w 37 ° C przez cztery godziny. Mieszaniny poddano następnie elektroforezie w 10% żelu akrylamidowym w warunkach redukujących w układzie buforowym Laemmli i analizowano za pomocą fotofluorografii.13 We wstępnych doświadczeniach z zastosowaniem szeregu stężeń oczyszczonej urokinazy, stwierdziliśmy, że zaledwie 0,0015 IU aktywności tworzenia urokaz wyraźnie widoczne łańcuchy lekkie plazmin 25-kD.
Kwantyfikacja antygenu Urokinazowego
Aby określić, czy ilość aktywnej urokinazy w próbce płynu płuczącego jest skorelowana ze stężeniem antygenu urokinazy, zastosowaliśmy modyfikację testu immunoabsorpcji z podwójną warstwą enzymu (ELISA) opisanego przez Astedta i współpracowników14. Monoklonalne i poliklonalne urokinazy Przeciwciała stosowane w tym teście scharakteryzowano gdzie indziej.14, 15. Określoną szybkość absorbancji określono przez pomiar całkowitej absorbancji w dołkach eksperymentalnych i odjęcie absorbancji w studzienkach kontrolnych zawierających przeciwciało, ale bez próbki (niespecyficzne tło) oraz w studzienki zawierające płyn do płukania i przeciwciało poliklonalne, ale bez przeciwciała monoklonalnego (niespecyficzna absorbancja). Podobnie jak w teście z płytką fibrynową, wygenerowano krzywą standardową dla urokinazy, która była liniowa od 0,04 do 1,0 IU na mililitr (R2> 0,90), z której obliczono stężenie urokinazy w płynie po przemyciu. W początkowych eksperymentach oceniano wpływ hamowania urokinazy przez inhibitor plazminogenu-aktywatora typu 2 (PAI-2) na wykrywanie urokinazy w teście ELISA. Kompleksowanie oczyszczonej urokinazy za pomocą PAI-2 (jedna godzina w 22 ° C) spowodowało zmniejszenie absorbancji urokinazy w tym teście o około połowę.
Test Fibrin Gel-Underlay
Obecność inhibitorów urokinazy badano metodą podłoża Granellusa-Piperno i Reicha na włóknie fibrynowym.16 Próbki po mililitrze płynu do płukania od zdrowych osób lub pacjentów z ARDS zatężono do 50 .l i poddano elektroforezie w 10% żelu poliakryloamidowym. wraz ze standardami masy molekularnej, urokinazy i tkankowego aktywatora plazminogenu, zostały nałożone na 1% żelach agarozowych zawierających fibrynę i plazminogen. W niektórych eksperymentach testowano podwójne żele, z których pominięto plazminogen
[przypisy: wole guzkowe, zapalenie nerwu twarzowego, wysokie trójglicerydy ]