Obniżona aktywność urokinaza oskrzelowo-pęcherzykowego u pacjentów z zespołem zaburzeń oddechowych dorosłych czesc 4

Technika ta umożliwiła scharakteryzowanie aktywatora plazminogenu jako typu tkanki lub typu urokinazy na podstawie jego względnej masy cząsteczkowej; ze względu na denaturację inhibitorów fibrynolizy podczas elektroforezy, umożliwiała także ekspresję utajonej aktywacji urokinazy, która została powstrzymana, ponieważ cząsteczki urokinazy utworzyły kompleksy z inhibitorami urokinazy. Dwie warstwy żelu inkubowano w 37 ° C i wizualnie sprawdzono prążki lizy fibryny po 4 i 24 godzinach. Pozorne masy cząsteczkowe obliczono z pozycji wzorców barwionych białek. Dwa najszybciej działające inhibitory aktywatorów plazminogenu są inhibitorem aktywatora plazminogenu typu (PAI-1), uważanym za główny inhibitor wydzielany przez komórki śródbłonka naczyniowego i zawarte w płytkach krwi oraz PAI-2, który jest związany głównie z łożyskiem. komórki tkanek i komórek podobnych do monocytów lub makrofagów. 17 18 19 20 21 Próbki płynu z płukania od zdrowych osób i pacjentów z ARDS poddano immunoadorbcji z monospecyficznymi przeciwciałami poliklonalnymi przeciwko PAI-1, PAI-2 lub fibronektynie. Immunoadsorbowane Urokinazę w postaci kompleksów enzym-inhibitor wykryto następnie w teście podłoże z żelem fibrynowym. Test ten zastosowano zamiast autografografii odwrotnej fibryny18, aby scharakteryzować inhibitory urokinazy, ponieważ autografografia odwrotnej fibryny jest mniej wrażliwa w wykrywaniu PAI-2 niż w PAI-1, podczas gdy kompleksy urokinaz z dowolnym inhibitorem mogą być badane bezpośrednio przez fibrynę. Technika żelowa.17, 18 Immunoadsorpcję przeprowadzono przez usunięcie endogennego IgG z płynu z płukania za pomocą kuleczek białka Sepharose z białkiem A (dwie inkubacje z 10 mg sefarozy białka A), następnie dodanie 100 do 150 .g IgG odpowiednich przeciwciał, inkubowanie mieszaniny w 4 ° C przez dwie godziny i strącanie jej świeżym sefarozą z białka A. Związany inhibitor, kompleksy enzym-inhibitor, lub oba, wymywano z kulek Sepharose przez inkubację w buforze do próbek żelowych w 37 ° C przez dwie godziny, a następnie elektroforezę i analizę w teście żelu fibrynowego dokładnie jak opisano powyżej.
Kózkowe poliklonalne przeciwciało PAI-2 zostało przygotowane i scharakteryzowane przez Lecandera i Astedta 20, a królicze przeciwciało PAI-1 zakupiono od firmy American Diagnostica (Greenwich, Connecticut). Jako kontrolę zastosowano króliczą anty-fibronektynę IgG (CalBiochem, La Jolla, CA). Początkowe eksperymenty z zastosowaniem oczyszczonej urokinazy (Winkinase, dzięki Amerykańskiemu Czerwonemu Krzyżowi), oczyszczonego PAI-1 (American Diagnostica) i częściowo oczyszczonego PAI-2 (Alpha Therapeutic, Los Angeles) wskazały, że przeciwciała PAI-1 i PAI-2 specyficznie wytrącone kompleksy urokinazy-PAI-1 i urokinazy-PAI-2, odpowiednio.
Analiza statystyczna
Przeprowadzono ciągłe analizy regresji liniowej i dokonano porównań między grupami za pomocą niesparowanego, dwustronnego testu t.22. Analizy przeprowadzono z pakietem oprogramowania Stat-View (Brainpower, Calabasas, CA).
Wyniki
Aktywność Urokinaza w płynie do płukania
Tabela 2. Tabela 2. Badanie aktywności białek i urokinaz ogółem w badanych próbkach oskrzelowo-pęcherzykowatych
[patrz też: wyniki tsh, zakrzepica leczenie, za krótkie wędzidełko ]